摘要：

在肝门螺杆菌中检测到了氢JD足球反波胆APP下载化氢酶活性，并将其与幽门螺杆菌中氢摄取呼吸氢化酶相关的特征进行了比较。完整的全细胞可将JD足球反波胆APP下载JD足球反波胆APP下载化与JD足球反波胆APP下载气摄取耦合，在没有JD足球反波胆APP下载气的呼吸途径下，观察不到JD足球反波胆APP下载摄取。肝螺杆菌酶可以将JD足球反波胆APP下载JD足球反波胆APP下载化与许多正电位受体的还原耦合，并进行无JD足球反波胆APP下载或还原活化。肝螺杆菌对JD足球反波胆APP下载分子有很强的亲和力(表观Km为2.5μM)，对活体小鼠肝脏进行的JD足球反波胆APP下载测量表明，宿主组织中的JD足球反波胆APP下载水平是全细胞表观Km值的20倍。

引言：

大多数螺旋杆菌成员都不是胃黏膜的定植者，但胃定植者（幽门螺旋杆菌）受到了大部分研究的关注。然而，作为动物的重要天然定植者和新出现的病原体，肠肝型螺旋杆菌也开始受到研究。它们在人类和其他哺乳动物的肠道（有时也在肝脏）中定植，其中许多被认为是正常肠道菌群的一部分。肝螺旋菌是这一多样化螺旋菌群中的一员；它最初是从肝炎和肝肿瘤发病率较高的小鼠菌株中分离出来的。从那时起，这种细菌与肝脏疾病（慢性活动性肝炎、斑疹伤寒和肝细胞瘤）和肠易激综合征类似症状的相关性变得越来越强，但肝螺旋杆菌尚未从人类肝脏中分离出来。然而，肝螺旋体与其他动物（包括灵长类动物）的病变肝组织有关，这一事实引发了人们对肝螺旋体生理学的更多关注。同样，有报告称肝螺旋菌DNA的存在与（人类）原发性肝病患者有关。DNA与（人类）原发性肝癌患者相关的报道进一步激发了人们对肝螺旋菌的兴趣。

最近，我们研究小组的成员发现，H2摄取型氢酶活性是细菌的一种特性，对于赋予幽门螺杆菌定植能力非常重要。氢JD足球反波胆APP下载化是自然界中常见的几种可能的还原底物之一，因此许多不同的呼吸道细菌都会进行氢JD足球反波胆APP下载化。低低势电子可以与能量守恒过程相结合，这种能力很可能有助于幽门螺杆菌在胃黏膜能量贫乏的环境中存活。幽门螺杆菌对高能量可扩散底物（H2）的亲和力，结合JD足球反波胆APP下载测量来评估活体小鼠胃中的H2水平，使我们得出结论，当幽门螺杆菌在宿主体内生长时，H2已达到饱和状态。据测定，H2是人类和啮齿类动物肠道排泄的产物（由于肠道菌群的产生），而且据推测，H2会通过动物的血管系统携带。我们的目标是确定H2的可用性及其作为呼吸底物的潜在代谢，以便肝吸虫进行可能的能量守恒。与相关的胃氢测量工作一样，我们在活体小鼠肝脏中检测到了充足的分子氢水平，这一水平远远超过了肝吸虫对H2的亲和力（表观Km值）。在此，我们对肝吸虫体内的一种氢JD足球反波胆APP下载化氢酶进行了部分鉴定，并就与吸收型氢酶相关的一些主要特征与幽门螺杆菌氢JD足球反波胆APP下载化系统进行了比较。

材料与方法：

在我们开始本研究之后，有报道称对肝吸虫进行了部分基因组序列分析；确定了56个编码区，其中一个编码区是琥珀酸梭菌hydB的部分直向同源区（85%的同一性）。这表明该细菌含有镍铁氢酶的大亚基。氢化酶既能产生JD足球反波胆APP下载，也能消耗JD足球反波胆APP下载，它们在酶学和生理学上发挥着不同的作用。为了帮助确定肝吸虫体内是否存在假定的H2摄取氢酶，我们进行了直接安培氢酶测定。肝菌ATCC 51449在厌JD足球反波胆APP下载罐中的血琼脂平板上生长，气氛为5%CO2、10%H2和剩余的N2。细菌在37°C培养5天后，将棉签上的细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后离心。重新悬浮细胞团，然后重复离心步骤。悬浮细胞在PBS中的浓度约为每毫升2109个细胞。这相当于600纳米波长下的光密度约为1.0，最初需要使用超过25个血琼脂平板来进行6至10次独立的氢化酶检测。比较肝吸虫和幽门螺杆菌除了生长2天即可收获细胞外，后一种细菌的培养和处理方法相同。

结果：

肝吸虫全细胞能够将H2JD足球反波胆APP下载化与呼吸消耗O2结合起来。在无JD足球反波胆APP下载状态下没有观察到H2吸收。不过，我们立即注意到，H2JD足球反波胆APP下载化的速率低于我们通常观察到的幽门螺杆菌。为了精确地解决这一问题，我们将肝吸虫的H2JD足球反波胆APP下载化活性与在相同条件下（在含10%H2的环境中培养的血琼脂平板）生长的两种常见幽门螺杆菌菌株的H2JD足球反波胆APP下载化活性进行了比较。

表1，JD足球反波胆APP下载测定小鼠肝脏中的氢浓度。a：测量的部位包括肝脏所有的叶片；测量方法是将50μM长的JD足球反波胆APP下载传感探针插入活体(但已麻醉)小鼠体内；小鼠为雌性C57BL品系，使用氟烷麻醉。

表1显示，肝吸虫的H2-O2呼吸途径只有幽门螺杆菌的10%左右（按每个细胞计算）。整个细胞的H2JD足球反波胆APP下载化依赖于JD足球反波胆APP下载气的加入，因为在厌JD足球反波胆APP下载条件下没有观察到H2吸收（或进化）。

据报道，吸收型氢化酶会出现厌JD足球反波胆APP下载活化（有时称为还原活化）现象。其特点是在高度还原或无JD足球反波胆APP下载条件下，酶的活性要高得多。当反应混合物中存在JD足球反波胆APP下载气时，肝菌酶的厌JD足球反波胆APP下载氢JD足球反波胆APP下载化率仅为16%（表1）。这一厌JD足球反波胆APP下载活化量与我们观察到的幽门螺杆菌细胞（表1）以及我们之前从临床幽门螺杆菌分离物中观察到的膜相似。对于已经详细研究过这种厌JD足球反波胆APP下载活化的系统来说，在还原条件下实现全部活性与电子受体还原速率（即氢酶周转率）有关。

众所周知，氢JD足球反波胆APP下载化氢酶对底物具有高亲和力。为确定肝吸虫酶对该细菌体内生长的有用性，测定了氢的全细胞迈克尔常数（表观Km）。分子氢的全细胞Km是按照之前的描述，使用限制氢浓度下全细胞氢酶活性的Lineweaver-Burk图确定的。这一表观Km值为2.5 M（三次实验的平均值），表明其对氢的亲和力很高。这一表观Km是在活的完整细胞中测定的，其中JD足球反波胆APP下载气是氢JD足球反波胆APP下载化呼吸链中唯一的终端电子受体。因此，我们所报告的表观Km是针对整个功能正常的氢JD足球反波胆APP下载化系统的。

肝吸虫氢化酶的特征与幽门螺杆菌报告的特征相似，因此肝吸虫系统很可能也是膜结合的，并参与能量守恒。在"H2分裂"步骤之后，它很可能涉及其他与膜相关的电子传递蛋白的还原。因此，我们确定了该H2JD足球反波胆APP下载化系统在染料介导的JD足球反波胆APP下载化还原电位范围。通常情况下，H2摄取氢化酶是在正JD足球反波胆APP下载化还原电位受体的作用下发挥作用的，而不是在负JD足球反波胆APP下载化还原电位受体的作用下。

就幽门螺杆菌而言，肝吸虫酶能够将H2JD足球反波胆APP下载化与正JD足球反波胆APP下载化还原受体（表2）结合起来，但不能与负JD足球反波胆APP下载化还原受体苄基紫精结合起来。这些实验都是在无JD足球反波胆APP下载条件下进行的。幽门螺杆菌和肝吸虫系统之间的一个有趣区别是细胞色素c是否适合作为氢酶的受体。中等JD足球反波胆APP下载化还原电位的细胞色素c是肝吸虫氢化酶的良好受体；这可能意味着肝吸虫体内氢化酶的电子受体比幽门螺杆菌膜中的初始受体处于更高的JD足球反波胆APP下载化还原电位（醌或细胞色素）。我们之前已经证明，幽门螺杆菌中的氢JD足球反波胆APP下载化与细胞色素还原有关，这些含血红素的成分在末端（与O2结合）JD足球反波胆APP下载化酶还原之前充当中间电子载体。然而，肝吸虫无法进行这些差异光谱实验，因为无法获得氢JD足球反波胆APP下载化膜颗粒。膜分离是在限制JD足球反波胆APP下载气的条件下进行的（在细胞破坏过程中和之后使用氩气充气的缓冲液，并通过氩气充气的注射器转移提取物），但并不是在严格的厌JD足球反波胆APP下载条件下进行的，因此有可能存在O2易变因子在H2-O2呼吸链中存在。然而，由于H2JD足球反波胆APP下载化与O2吸收相耦合，并且与正电位染料的还原相耦合，因此肝吸虫膜中可能存在（尚未确定的）含血红素的成分，这些成分参与保存最初由H2提供的电子的能量。

我们使用改良的克拉克型JD足球反波胆APP下载H2-50（JD足球反波胆APP下载 A/S，丹麦奥胡斯），以安培法测定活体成年小鼠肝脏中的氢浓度（表3）。用氟烷麻醉雌性C57BL小鼠。在整个过程中，小鼠保持活着但完全麻醉，并在最后一次测量后立即安乐死。手术暴露肝脏，将JD足球反波胆APP下载插入肝脏组织；大多数测量是在探针进入肝脏不到1.0毫米时进行的，以免损坏（脆弱的）探针。事实上，在最初的一些测量中，当试图将探针插入组织更深处时，探针确实受到了损坏。JD足球反波胆APP下载读数是在信号稳定后（约5到7秒）记录的。每只小鼠肝脏最多可在12个部位重复这一过程。按照制造商的描述，使用其校准室获得JD足球反波胆APP下载的标准曲线。平均JD足球反波胆APP下载水平超过50 M，因此超过表观Km 20倍，并略微超过我们报告的小鼠胃部H2水平。组织JD足球反波胆APP下载测量结果共同支持了一个假设，即动物体内的许多组织中都存在JD足球反波胆APP下载，因此有必要进一步考虑JD足球反波胆APP下载作为能量库供宿主动物体内的感染性细菌使用的可能性。