方法

动物

42只10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠来自上海SLAC实验动物有限公司。食物和水自由供应。所有动物实验方案均经上海体育大学和第二军医大学实验动物伦理委员会批准。

胎盘早剥和E2治疗

实验分两步进行。首先，21只大鼠被随机分配到三组：Sham组、OVX组和OVX-E2组(每组n=7)。在戊巴比妥钠(60毫克/千克)麻醉下进行双侧卵巢切除术。假手术也在戊巴比妥钠麻醉下进行。给切除卵巢的大鼠皮下注射E2 30μg/kg/d(OVX-E2组)或等体积的芝麻油作为药物对照(OVX组)。假大鼠在发情期被杀死。测量大鼠体重和子宫重量。收集血清以测定E2水平。收集左心室壁进行活检，并将其保存在-80℃温度下，以便随后测定RNA和蛋白质。为了进行免疫组化分析，将心肌组织置于10%磷酸盐缓冲福尔马林中。其次，将另外21只大鼠随机分配到上述三组(每组n=7)。收集心肌组织以测定H2S生成率、JD足球反波胆APP下载化状态和促炎细胞因子水平。

激素测定

E2使用市售的放射免疫测定试剂盒进行测定。测定内和测定间的平均变异系数分别为5.78%和6.96%。

免疫组织化学

心肌CSE免疫组化分析方法如前所述。简而言之，制备石蜡包埋切片(5μm)，重新水化，并在柠檬酸缓冲液中微波处理以提取抗原。用3%H2O2淬灭内源性过JD足球反波胆APP下载化物酶。切片与大鼠CSE抗体(1：100)在4℃孵育过夜。CSE抗体针对的是与人源CSEC端胞质结构域相匹配的多肽。以3,5-二氨基联苯胺为显色剂，用生物素-链霉亲和素-过JD足球反波胆APP下载化物酶系统(UltraSensitive-SP试剂盒)检测结合情况。阴性对照时，用10倍过量的阻断肽sc-131905P预吸附一抗。

细胞因子水平的测量

将心肌(100毫克)在1毫升磷酸盐缓冲生理盐水中均质化，该生理盐水中含有2毫摩尔苯甲基磺酰氟和1μg/ml的安替比林、利普汀和抑肽酶A。匀浆在1,000g转速下离心10分钟。上清液经0.45μm无菌滤器过滤后，在-80℃下保存，直至用于使用酶联免疫吸附测定试剂盒测定TNF-α和IL-6。TNF-α和IL-6的平均测定内变异系数分别为2.1%和4.5%。TNF-α和IL-6的平均测定间变异系数分别为8.8%和7.0%。

总RNA提取和定量实时反转录聚合酶链反应

总RNA提取和定量实时逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)的方法如前所述。简言之，使用TRIzol试剂制备总RNA。使用M-MLVRT，用寡聚(dT)引物反转录两微克RNA。在进行PCR分析之前，将得到的互补DNA储存在-20℃温度下。CSE(NM_017074)的引物为5'-CGGAGCAATGGAGTTCGC-3'(正向)和5'-GATGGGTAATCGTTGTGGTG-3'(反向)。使用MyiQ Single-Color实时监测PCR系统重复进行实时定量PCR分析。反应溶液由40ng的互补DNA产物、0.1μM配对引物和1×PCR Master Mix组成。检测染料为SYBR green。根据初步实验对条件进行了优化，以确保RNA浓度与PCR产物之间的线性关系。退火温度为58℃。扩增以40个循环进行。检测PCR产物熔化温度的温度范围设定为60℃至95℃。通过熔解曲线分析和实时RT-PCR产物测序验证引物特异性。β-Actin用作内对照，用于样品的加载和归一化。用算术公式(2-ΔΔCt)比较Ct(阈值周期)法确定CSE信使RNA(mRNA)的相对量。

Western blot分析

蛋白质提取和Western blot分析方法如前所述。简而言之，组织样本在冷的T-Per裂解缓冲液中均质化。裂解液在冰浴中快速超声，在95℃下煮沸5分钟，并在-80℃下保存直至使用。样品(50μg蛋白质)经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。在室温下，用含0.1%吐温-20和5%干奶(重量/体积)的三羟甲基氨基丙烷缓冲盐水将膜阻断2小时。用CSE抗体(1：1,000)或3-磷酸甘油醛脱氢酶抗体在4℃下孵育膜过夜。用含0.1%吐温-20的三相缓冲盐水冲洗后，用辣根过JD足球反波胆APP下载化物酶结合的二级IgG(1：1,000)在室温下孵育膜1小时。使用增强化学发光西部印迹检测系统对免疫反应蛋白进行检测。用密度计和GeneSnap及GeneTools软件分析条带的强度。结果以与3磷酸甘油醛磷酸脱氢酶对照的比率表示。

实时测量H2S量

组织中H2S的实时生成量测量方法如前所述。简而言之，将大约100毫克的大鼠心脏组织在含有蛋白酶抑制剂(2毫摩尔苯甲基磺酰氟、1毫摩尔正钒酸钠和10毫克/毫升杏仁蛋白)的冷磷酸盐缓冲盐水(5毫升)中剁成小颗粒，洗涤三次，匀浆15秒。在5,000rpm转速下离心5分钟后，将上清液放入温控微呼吸室(JD足球反波胆APP下载)，使用微型H2S微呼吸电极(型号H2S MRCh；JD足球反波胆APP下载)和JD足球反波胆APP下载 PA2000放大器测量实时H2S产量。使用改良的布拉德福德测定法测定蛋白质浓度。

还原型谷胱甘肽/JD足球反波胆APP下载化型谷胱甘肽含量、总抗JD足球反波胆APP下载化能力以及SOD和过JD足球反波胆APP下载化氢酶活性的测定

用冷生理盐水匀浆心肌(100毫克)。匀浆在1,000g转速下离心10分钟。还原型谷胱甘肽/JD足球反波胆APP下载化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值、总抗JD足球反波胆APP下载化能力(T-AOC)、SOD和过JD足球反波胆APP下载化氢酶(CAT)活性的测定采用Winching公司的试剂盒。GSH/GSSG、T-AOC、SOD和CAT的平均测定内变异系数分别为2.8%、3.2%、1.7%和1.9%。GSH/GSSG、T-AOC、SOD和CAT的平均测定间变异系数分别为5.32%、6.83%、3.52%和4.94%。