结果

心肌细胞表达CSE并产生H2S

图1心肌中γ半胱氨酸裂解酶(CSE)的表达和JD足球反波胆APP下载(H2S)的生成。A：左心室心肌的代表性CSE免疫染色。如箭头所示，染色主要定位于心肌细胞。B：阴性对照：CSE被过量10倍的阻断肽预吸收。C：心肌匀浆中H2S生成的代表性痕迹。在添加或不添加CSE抑制剂D,L-丙炔基甘氨酸(PAG)的情况下，通过添加L-半胱氨酸(L-cys)和磷酸吡哆醛(PLP)启动H2S生成。

CSE染色主要定位于心肌细胞(图1A，B)。用过量多肽预吸收一抗后，染色消失，从而证实了抗体的特异性。

如图1C所示，加入L-半胱氨酸后，心肌匀浆能产生H2S。CSE抑制剂D,L-丙炔甘氨酸阻断了H2S的产生。

E2治疗可增加卵巢切除大鼠心肌中CSE的表达和H2S的生成

表1 12周实验后的体重和E2水平

经卵巢切除术验证，血清E2水平显著降低，体重增加，子宫重量减少(表1)。E2治疗可逆转OVX引起的变化。

图2 17β-雌二醇(E2)疗法对卵巢切除大鼠心肌中γ半胱氨酸裂解酶(CSE)表达和JD足球反波胆APP下载(H2S)生成的影响。A、B：卵巢切除(OVX)组和OVX-E2组大鼠心肌中CSE信使RNA(mRNA)和蛋白水平以及H2S生成率。CSE mRNA和蛋白质(A)的水平分别通过定量实时逆转录聚合酶链反应和Western印迹分析测定。H2S生成率(B)通过实时H2S生成分析测定。用安慰剂治疗的卵巢切除大鼠作为对照组。C：H2S生成率与血清E2水平的相关性。采用皮尔逊相关分析E2水平与H2S生成率之间的关系。GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶。

E2疗法提高了CSE mRNA和蛋白水平(与单独OVX相比，mRNA和蛋白水平分别为P<0.05和P<0.01；图2A)。E2治疗增加了H2S生成率(与单纯OVX相比，P<0.05；图2B)。

H2S生成率与血清E2水平呈正相关(R2=0.808，P小于0.01；图2C)。

E2治疗对JD足球反波胆APP下载化状态的影响

图3 17β-雌二醇(E2)疗法对卵巢切除大鼠心肌JD足球反波胆APP下载化状态的影响。A-D：还原型谷胱甘肽/JD足球反波胆APP下载化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比率、总抗JD足球反波胆APP下载化能力(T-AOC)、过JD足球反波胆APP下载化氢酶(CAT)活性和超JD足球反波胆APP下载化物歧化酶(SOD)活性。E-H：E2水平与抗JD足球反波胆APP下载化生物标志物之间的相关性。采用皮尔逊相关分析E2水平与GSH/GSSG比率的相关性(E)、E2水平与T-AOC的相关性(F)、E2水平与CAT的相关性(G)以及E2水平与SOD的相关性(H)。

E2疗法提高了GSH/GSSG比值以及T-AOC、CAT和SOD的水平(GSH/GSSG比值、CAT活性和SOD活性P<0.05；T-AOC水平与单纯OVX相比P<0.01；图3A-D)。血清E2水平与GSH/GSSG比率以及T-AOC、CAT和SOD水平呈正相关(图3E-H)。

E2治疗对促炎细胞因子的影响

图4 17β-雌二醇(E2)疗法对卵巢切除大鼠心肌中促炎细胞因子水平的影响。A、B：心肌中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。通过酶联免疫吸附试验测定IL-6和TNF-α的水平。C、D：血清E2浓度与心肌IL-6或TNF-α水平的相关性。用皮尔逊相关分析E2水平与IL-6的相关性(C)和E2水平与TNF-α的相关性(D)。

E2治疗降低了心肌中IL-6和TNF-α的水平(P<0.05 vs OVX单药；图4A、B)。血清E2浓度与心肌中IL-6和TNF-α的浓度成反比(图4C、D)。

H2S生成与抗JD足球反波胆APP下载化生物标志物和促炎细胞因子之间的相关性

H2S生成率与T-AOC(R2=0.366，P<0.05)和GSH/GSSG比率(R2=0.453，P<0.01)呈正相关，但与SOD或CAT无关。H2S生成率与IL-6(R2=0.285，P<0.05)和TNF-α(R2=0.367，P<0.05)成反比。

讨论

本研究首次证实，皮下注射E2会增加卵巢切除大鼠心肌中CSE的表达和H2S的生成。心肌H2S生成率与血清E2水平呈正相关，这表明雌激素在维持心肌H2S生成方面起着关键作用。

我们实验室和其他实验室以前的研究表明，糖皮质激素可抑制脂多糖诱导的H2S生物合成和巨噬细胞中CSE的表达。胰岛素会降低肝脏中CSE的表达和活性，而胰高血糖素则会增加其表达和活性。本研究首次提供了雌激素可增加体内心肌中CSE表达和内源性H2S生成的直接证据。

JD足球反波胆APP下载化应激与各种绝经后心血管疾病的发生有关。雌激素对JD足球反波胆APP下载化应激的保护作用已在各种体外和体内模型中得到证实。先前的一项研究表明，雌激素分子中的A环酚羟基赋予了雌激素直接的抗JD足球反波胆APP下载化活性。此外，雌激素通过刺激谷胱甘肽过JD足球反波胆APP下载化物酶和SOD等抗JD足球反波胆APP下载化酶来发挥抗JD足球反波胆APP下载化活性。与这些研究结果一致，我们发现E2治疗可增加抗JD足球反波胆APP下载化生物标志物(T-AOC、GSH/GSSG比率以及抗JD足球反波胆APP下载化酶SOD和CAT的活性)。我们还发现血清E2水平与抗JD足球反波胆APP下载化生物标志物之间存在正相关，这进一步支持了E2的抗JD足球反波胆APP下载化作用。本研究中观察到的E2与JD足球反波胆APP下载化状态之间的相关性与之前的人体研究结果一致。例如，Serviddio等人的研究表明，正常子宫内膜的血浆E2与谷胱甘肽过JD足球反波胆APP下载化物酶活性之间存在正相关。Seino等人的研究报告称，体外受精-胚胎移植项目中妇女的卵泡液E2水平与积液细胞中的促JD足球反波胆APP下载化指数8-羟基-2-脱JD足球反波胆APP下载鸟苷呈负相关。然而，雌激素水平是否与患有心血管疾病的妇女体内的促JD足球反波胆APP下载化/抗JD足球反波胆APP下载化指数相关还需要进一步研究。

雌激素可抑制各种促炎细胞因子和趋化因子的产生。例如，接受雌激素治疗的老龄卵巢切除大鼠的心肌细胞中IL-6和TNF-α增加。小剂量雌激素的慢性治疗可降低更年期或卵巢切除术引起的细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1和巨噬细胞炎症蛋白-1α循环水平的升高。Pechenino等人报告说，早期E2治疗可预防OVX诱导的促炎细胞因子，如TNF-α，以及诱导型一JD足球反波胆APP下载化氮合酶。值得注意的是，人类研究表明，绝经后IL-6升高，而补充雌激素可使循环IL-6水平恢复正常。这些发现与我们的研究结果一致，即E2治疗可减少卵巢切除大鼠心肌中IL-6和TNF-α的产生。目前的研究发现，循环E2水平与心肌中IL-6和TNF-α水平成反比，这与下文所述的人体研究结果一致。在患有慢性丝虫感染的年轻加蓬妇女中发现，血清雌激素与干扰素-F水平之间存在很强的负相关。阿夫扎尔和卡纳姆证实，在患有骨关节炎的绝经后妇女中，IL-6与血清雌激素之间存在反相关关系。

H2S最明显的有益作用是防止JD足球反波胆APP下载化应激引起的损伤。H2S是活性JD足球反波胆APP下载和过JD足球反波胆APP下载化亚硝酸盐的直接清除剂。外源性给予饱和H2S溶液可增强大鼠心肌线粒体锰SOD的活性，从而减轻JD足球反波胆APP下载化应激损伤。本研究发现，心肌中H2S的产生与T-AOC和GSH/GSSG比率呈正相关，但与CAT和SOD活性无关。因此，内源性H2S如何在体内介导抗JD足球反波胆APP下载化作用仍有待阐明。不过，我们的数据表明，CSE/H2S系统是心肌中的一种内源性抗JD足球反波胆APP下载化应激防御系统。

关于H2S在调节炎症事件中的作用，存在相互矛盾的数据。例如，Li等人的研究表明，H2S本身会在肺组织中引发炎症反应，而抑制CSE的活性会产生明显的抗炎作用，并减轻内毒素诱导的肺损伤。H2S的抗炎作用包括减少中性粒细胞聚集、抑制促炎细胞因子的释放以及增加抗炎IL-10。在小鼠心肌缺血再灌注模型中，H2S供体可抑制中性粒细胞浸润和心肌中IL-1β的表达。Sivara-ah等人在大鼠区域性心肌缺血再灌注模型中也报道了H2S的抗炎作用。本研究发现，内源性H2S生成率与心肌中IL-6和TNF-α的浓度成反比，这表明内源性H2S可抑制体内心脏组织的炎症反应。

自然绝经或手术绝经的妇女失去卵巢周期性分泌的雌激素后，心脏病和中风的发病率较高。动物模型和临床试验研究表明，局部或全身的JD足球反波胆APP下载化应激和炎症与绝经后心脏病有关。研究结果还表明，雌激素疗法至少部分通过抑制JD足球反波胆APP下载化应激和炎症损伤而产生保护心脏的作用。

长期使用雌激素会产生许多不良影响，如增加罹患乳腺癌和血栓栓塞性疾病的风险。了解雌激素介导的心脏保护机制可能有助于最大限度地降低这些风险。考虑到H2S供体可改善各种心血管疾病，我们的研究结果鼓励进一步研究如何利用增强的H2S信号作为治疗绝经后心脏疾病的策略。

总结

本研究表明，雌激素可增加心肌中CSE的表达和内源性H2S的生成。这种效应与心肌JD足球反波胆APP下载化应激和炎症的减少有关。我们的研究表明，雌激素可能通过上调CSE的表达和H2S的生成来发挥保护心脏的作用。