方法

样本采集

用牙签或牙线从未用过抗生素、未被诊断患有牙周炎和/或其他严重疾病的男女志愿者(25至52岁)身上采集天然牙菌斑样本。

从同位素标记的NO3-中产生N2

用牙签从三名志愿者的牙齿表面和近端(IP)间隙收集牙齿生物膜，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS；JD足球反波胆APP下载7.2)中清洗两次。样本中的蛋白质含量按照Lowry的方法测定。生物膜经涡旋匀浆后，将每个个体的材料平均分配到三个外容器(3.8毫升)中，并注入空气饱和培养基(磷酸盐缓冲盐水和2%蔗糖)。加入50μM Na15NO3后立即开始培养，并在37温度下持续搅拌。在三个时间点(t0=0小时；t1=3.5小时；t2=5小时)加入最终浓度为0.5%的氯化锌停止生物反应之前，直接用O2JD足球反波胆APP下载测量溶解JD足球反波胆APP下载浓度。将2毫升氦气顶空引入封闭的外容器并在液相和气相之间进行平衡后，使用四极杆质谱仪测量30N2。

JD足球反波胆APP下载测量

两名志愿者的牙菌斑在口腔外用NO、N2O、O2、JD足球反波胆APP下载和NO3-JD足球反波胆APP下载进行了原位测量。将整块生物膜放在固体琼脂(1.5%)上，用一滴熔融琼脂(0.5%)固定，然后覆盖在无缓冲蔗糖/盐培养基(68mM NaCl、8mM MgCl2、3.6mM CaCl2、26.8mM KCl、2%蔗糖；JD足球反波胆APP下载6.6至7.2)上。测量前生物膜至少平衡20分钟，测量在生物膜回收后6-8小时内进行。NO、N2O和O2以及离子选择性JD足球反波胆APP下载和NO3-JD足球反波胆APP下载的制造和微传感器的测量按照之前的描述进行。在添加760μM NaNO3之前和之后测量稳态微档案，同时在介质表面喷射空气，在生物膜上方形成恒定的流动机制。为了研究生物膜中JD足球反波胆APP下载值为6至7的氮循环，培养基中添加了磷酸盐缓冲液(10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，JD足球反波胆APP下载值为7.2；类似于1×PBS中的浓度)，从而排除了NO2-的化学还原。为了提高传感器的性能，在含盐量较低的培养基中，以及在存在和不存在50μM NaNO3(而不是760μM)的情况下测量了NO3-微谱分析。所有测量都是在同一个生物膜点进行的。因此，这些测量结果适用于得出机理结论。不过，这些数据没有考虑生物膜的异质性，不适合计算特定生物膜表面的平均通量。我们用第二个个体的生物膜重复了相同的实验，结果显示了相同的处理效果。

牙科生物膜中脱氮基因的分子分析

五名志愿者在12小时内未刷牙或进食，用无菌牙签从牙齿表面和IP间隙收集牙菌斑，按照牙菌斑优化方案提取DNA。反硝化基因narG、nirS、nirK、cnorB、qnorB和nosZ部分序列的PCR扩增在总体积为20μl的10×PCR缓冲液中进行，缓冲液中含有2μl 10×PCR缓冲液、250μM三磷酸脱JD足球反波胆APP下载核苷、1U Taq聚合酶、0.3mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、每种引物0.5μM和10至100ng DNA。所使用的引物针对不同生物的多种反硝化基因，PCR实验按照相应方案中的描述进行，并做了一些修改。扩增子在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析，然后进行溴化乙锭染色。对22个扩增子中11个具有预期大小的扩增子构建了克隆文库并进行了测序，以确认PCR产物与目标基因相对应。使用QIAQuick PCR纯化试剂盒纯化扩增子，并按照制造商的说明使用TOPO TA克隆系统进行克隆。获得的序列通过BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov进行分析。11个克隆文库中只有1个不含目标基因(nirS，研究对象D)。

口腔空气中的N2O积累

共有15名志愿者(25至52岁)被要求在测量前一天晚上和早上不刷牙。他们可以进食和饮水，但在测量前的最后一小时内不得进食和饮水。为了只测量口腔中产生的N2O，而不测量肺或胃中产生的N2O，我们向空口注入环境空气(30毫升)。随后，我们要求志愿者用鼻子呼吸，同时将嘴与鼻咽部隔开，并将注入的空气留在口中。我们将这种空气定义为口腔空气，其中积聚了口腔产生的N2O。分别在30秒和90秒后通过注射器的钝头抽取两份气体样本(1毫升)，并将其注入气密性外容器(3毫升)中。志愿者在未刷牙和刷牙的情况下重复此采样方案各五次。此外，还按照包装上的说明，测量了7名志愿者在刷牙和使用含洗必泰的消毒漱口水1分钟后的N2O累积率。刷牙前，志愿者收集1毫升唾液，并立即冷冻，以备日后分析NO3-/NO2-的浓度。使用配备63Ni电子捕获检测器的气相色谱仪分析口腔空气中的N2O浓度。根据30秒到90秒之间的浓度差和培养空气量，计算出N2O的积累率(单位：nmol/个体/小时)。在其他试验中，口腔空气中N2O浓度的增加至少在240秒内是线性的。

在另一项实验中，四名未刷牙的志愿者在饮用200毫升含有12毫摩尔NO3-的甜菜根汁之前和之后2小时测定了N2O的积累率。志愿者在饮用甜菜根汁之前和之后每小时采集0.5毫升唾液，用于随后的NO3-/NO2-浓度分析。一般在饮用甜菜根汁2小时后测量唾液中NO3-和NO2-的最高浓度。唾液样本经离心清除后，用VCl3还原法分析NO3-/NO2-浓度，然后用化学发光检测器测量NO。