材料与方法:

实验程序:

组织恢复方法获得了新西兰怀卡托大学动物伦理委员会的批准。

藻类培养:

衣藻(野生型1690)在250mL的棉塞Duran玻璃瓶中用100mL磷酸三乙酸酯(TAP)培养基培养7-10天,接种自在含琼脂15g/L的灭菌固体TAP培养基上培养的菌落。液体培养基建立后,每周用100毫升TAP培养基补充10毫升藻类悬浮液。培养条件为室温(20.5±0.5°C),使用磁力搅拌器(250rpm)或通气(300mL/min)持续搅拌。恒定光源位于培养容器上方20厘米处。

JD足球反波胆APP下载气测量:

溶解JD足球反波胆APP下载浓度(毫克/升)是使用克拉克型JD足球反波胆APP下载电极(尖端直径25微米)(丹麦JD足球反波胆APP下载有限公司)测量的,该电极与单通道微传感器装置相连,并以5赫兹的速率采样。每天开始时对电极进行极化,以获得稳定的输出。在与室内空气平衡的溶液和0.1M抗坏血酸钠(零点)中进行两点校准。

衣藻培养的JD足球反波胆APP下载气产量:

皮层脑组织在体外人工脑脊液(aCSF)中保存,这种盐培养基的成分与用于培养衣藻的TAP培养基有很大不同。因此,有必要确认悬浮在人工脑脊液中的藻类培养物是有生命力的,并且能够产生可能支持大脑皮层新陈代谢的JD足球反波胆APP下载气。

无镁无碳酸盐层中的JD足球反波胆APP下载气产生量(n=5):

将TAP培养基中的藻类悬浮液(30mL)转移到10mL管中,并通过离心(4,400rpm,8分钟)将细胞与TAP培养基分离。除去TAP培养基上清液,将细胞重悬于不含镁离子的30mL室内平衡aCSF中。从无镁脑脊液中去除镁离子可支持大脑皮层切片组织的网络活动的大脑皮层切片实验。无镁aCSF由124mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、2.5mM NaHCO3、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖组成。LED光源位于样品上方10厘米处,测量值为灯泡底部到容器中部的垂直距离。样品处的光强(LUX)测量值为310?mol/m2。在室温(20.5±0.5?C)条件下,持续光照90分钟,在培养基表面下约3毫米处测量JD足球反波胆APP下载气含量。定期轻轻搅拌培养物,以防止藻类沉淀。

干重电池质量:

产JD足球反波胆APP下载测试结束后,对部分样本(n=4)的藻类干重(DW)进行量化。将样品转移到预先称重的10毫升试管中,以每分钟4,400转的转速离心15分钟,直至上清液变清。小心去除上清液,将细胞物质留在试管底部。将试管放入约100?C的对流烘箱中烘干60分钟。重新称量试管,得出细胞材料的干重。

皮层切片制备,组织解剖和制备:

皮质切片按照常规方法制备。简单地说,用二JD足球反波胆APP下载化碳麻醉成年雄性或雌性C57小鼠,迅速解剖大脑并将其浸没在由125mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、2.5mM NaHCO3、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖组成的冰冷"正常"aCSF中。使用振动切片机将大脑冠状切成Bregma1至5之间400?m厚的切片。随后,在室温(约21?C)下将切片浸入无镁aCSF中至少60分钟。所有溶液都通过95%JD足球反波胆APP下载气(氮气平衡)的"传统"气泡充JD足球反波胆APP下载。

皮层切片制备,癫痫样事件(SLE)活动的组织记录:

组织制备完成后,切片被转移到灌注记录槽中,并浸没在无镁无碳酸盐溶液中。将大脑皮层切片暴露在无镁的无碳酸盐溶液中,可通过解除对NMDA受体的阻断来激活组织,从而产生重复的、自发的阵发性事件,即癫痫发作样事件(SLEs)。所有皮层和区域均可记录SLE,它反映了兴奋性和抑制性神经元混合群的协调发射。SLE参数可用作组织代谢状态和存活率的指南,本研究利用这些参数来确定藻类培养物是否能支持无血管皮层组织中的能量网络活动。特别是,SLEs数量(频率)和大小(振幅和长度)的减少反映了组织受到新陈代谢的挑战。

皮层系统性红斑狼疮活动是通过一个75微米的Ag/AgCl电极在细胞外记录的。在记录槽中与切片相距较远的一个圆盘银/氯化银电极被用作共同参考/接地。模拟信号被放大1000倍,并转换成数字信号,用于后期分析。模拟信号经过以下滤波:高通∥1Hz,低通∥300Hz,陷波滤波器为50Hz,采样率为1000s∥1。

皮层切片实验方案1:急性(30分钟)海藻暴露:

这组实验的目的是确定在以光合作用为唯一JD足球反波胆APP下载气补充来源的藻类环境中,大脑皮层网络动态是否能够得到支持。

将皮层切片转移到浸没式灌注浴中。在灌注(5mL/min)无镁aCSF的同时,在每个切片的单个皮层位置建立系统性红斑狼疮活动基线,该aCSF通过气泡式95%JD足球反波胆APP下载气和平衡氮进行常规充JD足球反波胆APP下载。灌注是通过重力从位于灌注浴上方60厘米处的贮水池中输入的。在建立稳定的基线SLE活性后,对无镁aCSF(如上所述制备)中的藻类悬浮液灌注约30分钟(n=9)。灌注浴用10WLED灯点亮,LED灯略微倾斜,高出灌注浴10厘米。升高的培养槽用一个14W的LED灯点亮,该LED灯位于培养槽容器上方10厘米处。培养液未进行外部充JD足球反波胆APP下载。然后用未充JD足球反波胆APP下载(室内平衡)的无镁aCSF向浴槽灌注约20分钟,然后再回到常规充JD足球反波胆APP下载的无镁aCSF。有三次,每次灌注一个切片;有两次,同时灌注三个切片,每个切片只有一个记录位置。在一次试验中,藻类培养液换成了灌注的含JD足球反波胆APP下载无镁脑脊液,并完全重复了无JD足球反波胆APP下载无镁脑脊液的试验方案(使用相同的切片和记录位置)。

在另一组实验中(n=6),切片在基线记录后暴露于"脱JD足球反波胆APP下载"的无镁aCSF中。为了使JD足球反波胆APP下载气浓度低于未缺JD足球反波胆APP下载的室温平衡aCSF,在加入aCSF盐之前,先将蒸馏水煮沸4-5分钟,然后将其置于无空气的密闭容器中,冷却至室温(使aCSF的JD足球反波胆APP下载气水平达到1-2mg/L)。

这些方案提供了四种脑脊液充JD足球反波胆APP下载条件,用于比较对系统性红斑狼疮活动的影响:常规充JD足球反波胆APP下载(用95%的JD足球反波胆APP下载气鼓泡);光合藻类充JD足球反波胆APP下载;不充JD足球反波胆APP下载(室内平衡)和脱JD足球反波胆APP下载。假设没有急性毒性,我们的假设是,在暴露于藻类期间,大脑皮层的动态将保持不变,但当室内平衡和脱JD足球反波胆APP下载aCSF中的JD足球反波胆APP下载含量降低时,大脑皮层的动态将受到明显抑制。

作为对照,将切片(n=6)暴露于未吸JD足球反波胆APP下载的aCSF中,同时照亮或不照亮aCSF储库和切片灌注浴。

皮层切片实验方案2:组织和aCSFJD足球反波胆APP下载合:

这组实验的目的是量化不同充JD足球反波胆APP下载条件下脑脊液和大脑皮层组织中的JD足球反波胆APP下载含量:常规充JD足球反波胆APP下载(n=12);光合藻类充JD足球反波胆APP下载(n=7);无充JD足球反波胆APP下载(n=12)。

由于浸没皮层切片实验中的JD足球反波胆APP下载浓度随aCSF深度变化很大,因此要生成从aCSF表面到切片中部的JD足球反波胆APP下载曲线。根据上述实验条件将皮层切片置于灌注浴中,使用精密微型机械手电极以150微米的步长前进,直到尖端停留在切片表面,然后以100微米的步长进入皮层III-IV层,深度约为300微米。每前进一步,先让JD足球反波胆APP下载气水平稳定下来,然后再读取读数并进行下一步调整。JD足球反波胆APP下载信号以5Hz的采样率连续记录。

皮层切片实验方案3:长时间(5小时)接触藻类:

这组实验的目的是确定长期接触海藻是否会对大脑皮层神经生理学产生毒性影响。

按上述方法制备一只动物的切片(n=6)。将每只动物的三片切片分别放入装有无镁aCSF和无镁aCSF中藻类培养液的静态室(约200mL)中。为防止藻类沉淀,两个室都用室内空气充气,充气量约为300mL/min。两个培养室都没有进行外部充JD足球反波胆APP下载。藻类室从上方用14瓦的白色发光二极管照明,距离5-10厘米。定期测量藻室中的JD足球反波胆APP下载气含量。

将每片切片从试验室中取出,在记录槽中灌注(5mL/min)无镁aCSF。记录六个位置,每个半球三个,大致等距。每个位置至少记录五个SLE。如果在3分钟内没有SLE或在10分钟内SLE少于5个,则认为该部位处于非活动状态。2小时测试后,将切片放回各自的腔室,5小时后再次测试。

数据分析:

切片性能通过量化三个SLE参数来评估:长度、振幅和事件频率。缺JD足球反波胆APP下载导致的组织功能衰退表现为SLE更小、频率更低。长度和振幅按四个连续事件的平均值计算。根据原始记录量化2分钟内的SLE频率。通过计算50秒窗口内原始波形的平均绝对电压来量化组织活动的整体度量,事件间期归一化为零。这实际上给出了电压波形下的平均面积,将SLE振幅、频率和长度整合为一个单一指标,我们称之为"整体"活动。

采用重复测量方差分析(正态分布数据)和弗里德曼检验(非正态分布数据)对多组比较的系统性红斑狼疮参数进行检验。配对比较采用Wilcoxon检验(正态分布数据)和配对t检验(非正态分布数据)。p值小于0.05即为具有统计学意义。